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发表论文
钩藤单体提取
钩藤碱的提取及含量测定方法的比较
曾启华1,黄竹发,姚赛
遵义师范学院 化学化工学院,贵州 遵义 563002
贵州省黔北特色资源应用研究实验室,贵州 遵义 563002
摘要:本文从钩藤碱的药材来源、提取部位、前处理条件、提取试剂选择、分离纯化条件、分析测试
方法等方面作了较全面分析对比。就目前钩藤碱提取、纯化和测定中的一些难点问题进行了探讨,并提
出了工业化提取钩藤碱的合理化建议。
关键词:钩藤碱;提取方法;测定方法;比较
Comprison on the extraction and content determination method of the rhynchophylline
ZENG Qi-hua, HUANG Zu-fa, YAO Sai
Chemical Engineering, Zunyi Normal College, GuiZhou Zun Yi 563002, China
Laboratory of Utilization Research on Characteristic Resources in Qianbei, GuiZhou Zun Yi 563002 ,China
Abstract:This review mainly highlights the comprison of the resource, extract parts, pretreatment condition,
extraction agents, separation and purification conditions and analytical method for the rhynchophylline. The
difficult problems on the extraction, purification and analytical method of the rhynchophylline have been
discussed and some reasonable suggestions on the industrial extraction of the rhynchophylline are also
included.
Keywords:Rhynchophylline; Extraction method; Analytical method; Comprison
1 前言
钩藤碱为传统中药钩藤属植物有效成分的主要成分之一,对人体心血管系统、中枢神
经系统以及血液系统等具有明确的生物活性作用[1-3],是治疗高血压方剂的常用药源,具有
清热平肝、息风定惊的功效[4-5]。能用于感冒夹惊、头痛眩晕、妊娠子痢、惊痢抽搐等的治
疗[6]。最新的研究表明,钩藤碱还具有抗血栓的形成和抗血小板凝聚的作用[7]。钩藤主要
分布于福建、江西、广东、广西、湖南等地。由于其在治疗高血压上的显著药用价值,钩
藤碱的提取成为近年来科学研究的一个热点[8-14]。目前,钩藤碱的提取方法虽然很多,但
都不是很理想,尤其是在工业化提取过程中有很多问题尚未解决[15]。本文从钩藤的选择出
发,就钩藤碱的提取、分离、纯化、分析测试以及工业化应用等方面进行了较全面地对比
分析和总结。
2 钩藤的选择
研究钩藤碱的提取方法,首先要从钩藤的选择出发,因为不同种属、不同产地、不同
部位的钩藤其钩藤总碱的含量不同。另外,不同的前处理方法对钩藤碱的提取也有很大的
收稿日期:2013-09-30
基金项目:遵义市科技局资助项目(遵市科合社字[2009] 17 号)
作者简介:曾启华(1958--),男,教授。主要从事有机化合物的应用研究。E-mail:zengqihua666@163.com
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影响。
2.1 钩藤种属对钩藤碱含量的影响
仲耘[1]等对钩藤及同属植物生物碱研究发现,钩藤中的钩藤碱、异钩藤碱、华钩藤、大
叶钩藤的含量较高,无柄果钩藤次之,毛钩藤中的钩藤碱、异钩藤碱的含量在检测限下,
但是毛钩藤碱及其总碱则含量较高。有人进一步测定了该5种钩藤属植物钩藤中钩藤碱的
含量,其顺序为:大叶钩藤>华钩藤>无柄果钩藤>钩藤>毛钩藤[2-3] 。
2.2 钩藤产地对钩藤碱含量的影响
郑虎占等[4]虽然对湖南、广西、江西、四川等不同产地的钩藤中钩藤碱进行了含量测定,
结果是江西九江最高,广西南宁最低。刘新民等[3]另外又考察了山西、四川、广西、湖南
和贵州产的钩藤,即结果发现湖南产钩藤碱含量较高。刘明等[6]对江西、福建等不同产地
钩藤药材中的钩藤碱类成分进行了研究,研究发现不同产地钩藤药材主要钩藤碱的化学成
分含量与质量存在着一定差异,福建三明产的钩藤药材中,钩藤碱的平均含量明显高于江
西产的钩藤药材的钩藤碱,与广东产的钩藤药材中钩藤碱含量相当。阮俊等[7]在研究广西
大叶钩藤碱变化规律发时现,开发已久的次生林、生长环境比较湿润、土质肥沃的地域,
钩藤总碱含量相对较高;生长在干旱地方、石灰岩土质的含量较低。
2.3 钩藤提取部位对钩藤碱的含量的影响
研究人员采用高效液相色谱法(HPLC)对钩藤各植物部位钩藤碱含量的影响进行了分
析[19],结果表明钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、去氢异钩藤碱在钩藤总碱中约占97%,
其主要分布于根、茎、叶中;毛钩藤碱、去氢毛钩藤碱约有96%存在于地下部分的根皮中。
仲耘等[1]研究发现钩藤碱以根和带钩茎枝含量较高。阮俊等[5]对大叶钩藤、毛钩藤的嫩枝
和叶进行含量追踪检测,结果发现嫩枝和叶中的钩藤总碱每年均呈周期性变化,即1、2、
3、12月4个月最低,6、7、8月这3个月中钩藤总碱的含量最高;根、茎、带钩枝、叶、嫩
枝均含有钩藤总碱,含量最高的是叶,其次为根、嫩枝、带钩枝和茎。
2.4 钩藤的前处理对钩藤碱的含量影响
覃冬杰等[9]人研究了干燥条件对钩藤碱含量的影响,结果表明阴干168h与阳光下暴晒
40h的样品中钩藤碱含量比其他方法干燥的样品中钩藤碱含量高。因此,钩藤药材比较适
宜采用阴干或暴晒的方法干燥,不适宜长时间高温烘干。
3 钩藤碱的提取与纯化
钩藤碱的提取方法有很多种,酸水提取法、溶剂提取法、超临界CO2萃取、醇类提取法
等,提纯过程又有:重结晶法、离子交换树脂柱法、柱层析法、高效液相色谱法及超高液
相色谱法等等。钩藤碱提取时的溶剂选择,提取技术等对钩藤碱含量及纯度有很大影响。
3.1 钩藤碱提取方法的对比
钩藤碱的提取工艺对其含量和稳定性有很大影响。由于钩藤碱的热稳定性较差,在81℃
时即有部分分解,钩藤碱的酯键受热易断裂, 并在极性条件下易转化为异钩藤碱,且转
化率在60%以上[8]。因此,钩藤碱的提取方法一般不使用酸水提取法。又因为游离钩藤碱
易溶于有机溶剂,目前采用最多的就是采用溶剂提取法,提取出钩藤总碱,然后再从钩藤
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总碱中分离提纯钩藤碱。
目前已经知道的可以用于提取钩藤碱的溶剂有乙酸乙酯、氯仿、乙醚、甲苯、苯等。
李雅臣等[10]使用乙醚、乙酸乙酯、氯仿三种有机溶剂提取钩藤碱的含量进行了研究,并首
次使用乙酸乙酯对钩藤碱进行了提取,研究表明这三种溶剂中乙醚的提取量最多,是提取
钩藤碱的适宜溶剂。在此基础上,郑嘉宁等[11]人又使用氯仿、甲苯及石油醚与乙酸乙酯的
混合溶剂进行钩藤碱的提取,最终发现甲苯作为钩藤碱的提取溶剂,其沸点太高,浓缩困
难,石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂提取,其会破坏钩藤碱的结构。而氯仿作为溶剂提取钩
藤碱效率较好,且价格适中,适合作为工业化提取钩藤碱的溶剂。李维锋等[12]对乙酸乙酯、
氯仿、乙醚、甲苯、石油醚与乙酸乙酯混合溶剂(5:3)等有机溶剂对钩藤总碱提取的影响进
行了研究。结果发现氯仿、乙醚的提取效果最好,钩藤总碱的含量顺序为:乙醚>氯仿>石
油醚与乙酸乙酯混合溶剂>乙酸乙酯;仲耘等[1]对钩藤总碱进行了甲醇、乙醇、乙酸乙酯、
苯、氯仿、乙酸乙酯等6种不同有机溶剂提取的比较试验,结果得出氯仿是提取钩藤总碱
的最佳溶剂,各溶剂中钩藤总碱含量大小顺序为:氯仿>苯>乙醇>甲醇。
梁勇等[13]研究使用乙醇提取钩藤总碱,并对使用乙醇和其他有机溶剂做了对比研究,
根据钩藤碱的物化性质,主要用95%乙醇0.1%盐酸混合液热回流提取和80 %乙醇0.1%盐酸
混合液温浴的提取条件对钩藤总碱提取的影响进行考察。认为采用0.1%盐酸作为钩藤总碱
的提取溶剂,就可以提取大部分的钩藤碱,而且乙醇也较容易回收、经济等。
在此研究基础上,李晓云等[14]采用正交法优选了钩藤中钩藤碱的乙醇提取工艺,认为
乙醇最佳提取工艺条件为90%乙醇热回流3次,每次3 h,在此条件下,测得钩藤碱的平均
含量为0.32%,该提取方法具有稳定性好、操作简单、钩藤碱的得率高、生产成本低等优
点,较适合于工业化生产。申金龙[15]等采用对比超声辅助酸性醇及超声辅助酸性醇回流2
种提取钩藤碱的方法。经过对乙醇浓度,pH值、超声浸提时间等,以正交试验和单因素相
结合的方法进行研究,确定了钩藤药材中钩藤总碱的最佳提取条件为:乙醇浓度为70%、
pH值为1、超声浸提时间为75 min。梁勇等[13]采用强酸性阳离子树脂提取钩藤药材的钩藤
总碱,结果发现0.1%盐酸乙醇溶液作为提取溶剂时提取的钩藤总碱量最多,001×7型强酸
性阳离子树脂分离效果最好。武建卓等[16]发明了一种采用离子交换树脂分离钩藤总碱的方
法,即通过将调整好pH值的钩藤提取液,进行阳离子交换树脂柱处理,分别以水、含酸或
乙醇的0.5%~20%盐溶液洗脱,收集洗脱液,加碱中和,经脱盐处理后,浓缩干燥后得到
钩藤总碱。该方法克服了现有技术提取效率低、酸碱浓度过高、工艺复杂、有机溶剂用量
大、无法大生产等不足,可以高效率地从钩藤中提取液中分离得到高纯度的钩藤总碱。
钩藤碱的提取如选用乙醚、乙醇、苯、甲苯等溶剂,存在于其沸点低、易燃,安全性
较差;选用氯仿、甲醇等溶剂存在毒性较大;实验室小量提取尚好控制,而对于大规模提
取则危险性较大[14]。比如选用酸水作为提取溶剂,虽然经济简便,但回收困难、易腐蚀。
因此,为保证钩藤碱不易分解转化、提取率高而又安全,并能适用于大规模提取钩藤总碱
的溶剂有进一步研究的必要。
3.2 钩藤碱的纯化技术
3.2.1 重结晶
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钩藤碱难溶于石油醚,而在乙酸乙酯中却有较好溶解度,因此在纯化方面能根据合
适体积比的混合溶剂进行重结晶。比如,一种方法是取粗提取的钩藤总碱用70%乙醇溶液
回流提取三次,减压回收乙醇至到无醇味,析出棕红色的沉淀,过滤出沉淀,滤液中加入
10%的氯化钠溶液,再用氨水溶液调PH为9~10,放置过夜,过滤出沉淀,将两次沉淀合并,
干燥后即得钩藤总碱。钩藤总碱经过氯仿回流提取后用0.5%硫酸萃取2次,两次萃取液分
别用浓氨水调PH为9~10,过滤出沉淀,沉淀自然干燥后,用乙醚、乙酸乙酯等进行重结晶,
最后获得较好的少量粒状体晶,并且纯度较高。另一种方法是将粗提取的钩藤总碱用10%
碳酸氢钠溶液润湿后,乙醚回流提取2次,浓缩至1/3体积,放置冰水中,析出无色结晶。
滤出结晶,干燥后经乙醚、丙酮、乙酸乙酯等进行重结晶,得到无色针状结晶。剩余乙醚
液用少量0.5%硫酸萃取2次,萃取液分别用浓氨水调PH为9~10,放置后,第1次萃取析出白
色沉淀,滤出沉淀,自然干燥后即得钩藤总碱。第2次萃取液碱化后并没有见到有沉淀析
出,就不必再继续进行提取工作了。所得钩藤总碱用氯仿、硫酸等来进行萃取,经过碱化
后析出沉淀。沉淀自然干燥后经乙醇-水溶液重结晶,得到无色棱状晶体,再经乙醚、乙酸
乙酯等来重结晶,同样也可获得无色针状晶体。但是由于钩藤碱对热很不稳定,而且在极
性溶剂中又容易转化成异钩藤碱,因此在实验过程中应该注意将温度控制在81℃以下并且
应在非极性溶剂中进行[8]。
3.2.2 离子交换柱层析
梁勇等[13]对比弱酸性阳离子树脂和强酸性阳离子树脂进行钩藤碱的提纯的影响,结果
表明弱酸性阳离子树脂吸附力大,而且在使用强酸性阳离子树脂上也是如此[19],从树脂中
洗脱出杂质时,起初只是用蒸馏水洗脱并不能把杂质完全洗脱下来,用蒸馏水洗完后再用
乙醇溶液浸泡洗脱,就可以把大部分杂质除去,或者把树脂从离子柱上拿下,放在烧杯中
用乙醇溶液清洗,更容易除去杂质而不损失钩藤碱。钩藤总碱的不同分离条件的选择,结
果表明739 型强酸性阳离子树脂吸附钩藤碱的量少,吸附不稳定,洗脱出来的杂质较多,
不是很理想的分离材料。001×7型强酸性阳离子树脂也能吸附分离大部分的原料药材中的
钩藤碱,杂质也能洗脱掉。所以,用0.1%盐酸80%乙醇的混合液作为提取溶剂,采用001×7
型强酸性阳离子树脂提取、分离钩藤总碱是一种经济简便、效率较高的方法。
4. 钩藤碱含量测定
钩藤碱的含量测定主要用于钩藤属钩藤药材的质量控制。目前其测定方法主要有高效
液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPEC)、薄层色谱扫描法(TLCS)、分光光度法和
容量法等。
4.1 高效液相色谱法
HPLC具有分离效能高、分析速度快、自动化程度高、灵敏度高等优点。该法近些年在
钩藤碱含量测定中被广泛应用。刘清华等[17]采用反相高效液相色谱法(RP—HPLC)测定了
钩藤药材中的钩藤碱在沸水下的煎出量及其变化规律。结果表明钩藤碱在汤药中的含量在
11.4 min达高峰,其后汤药中钩藤碱的含量逐渐降低。
4.2 高效毛细管电泳法
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高效毛细管电泳法(HPEC)与高效液相色谱法(HPLC)相比,HPEC具有分离时间更短、
杂质干扰更少、使用有机溶剂少、操作简便等优点,满足了钩藤碱多组分同时测定的要求。
陈思莳等[16]采用该法对钩藤药材中的钩藤碱、异钩藤碱的含量进行了测定。
4.3 薄层扫描色谱法
薄层色谱法(TLCS)也是钩藤碱分析的重要方法之一,具有操作简便、色谱结果直观、
分离鉴定双重功能、灵敏度高等优点。唐勇琛[19]采用薄层色谱 (TLCS)反射法双波长锯齿
形扫描,考察了贵州野生和栽培钩藤药材质量稳定性和一致性,确认了不同种钩藤药材中
钩藤碱的成分类别和含量差异,并建立了钩藤药材薄层色谱特征谱图。
4.4 分光光度法
紫外分光光度法是一种灵敏度较高的定量分析方法之一,该法具有测定条件稳定易控
制、操作简单等优点,由于不具备分离功能,因此常常被用于钩藤碱总量的测定。杨家强
等[20]、仲耘等[1]采用紫外分光法,以钩藤碱为对照品,测定了钩藤属l3种钩藤植物钩藤中
钩藤碱、异钩藤碱等的含量,并以钩藤碱计算其钩藤总碱含量。
5 结论
药理研究表明,钩藤碱在医药应用方面十分广泛,但主要是以钩藤药材提取混合物来
生产复方制剂,尚未见到利用钩藤碱纯品进行医药产品生产的相关报道。其原因在于当前
钩藤碱的提取工艺不成熟,无法实现大规模工业化提取,因而极大的限制了钩藤碱医药产
品的开发。目前,工业化生产钩藤碱主要通过有机溶剂提取的方法,粗产品经过离子交换
柱分离纯化。这种方法较以前的钩藤碱提取工艺有了较大的改进。但这种方法同样也存在
钩藤碱纯度不高,产品分离率不高的问题,同时钩藤碱的提取,使用的有机溶剂会严重污
染环境和危害人体健康。
因此,在优化钩藤碱提取工艺,实现工业化生产方面尚有较大的提升空间。在寻找绿
色环保、无毒无害的提取方法等方面,是今后研究人员和企业规模化提取钩藤碱的研究任
务。
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